Le soluzioni tampone sono importantissime sia in chimica che in biologia, poiché permettono di lavorare in un ambiente a pH controllato. Molte reazioni chimiche, per esempio, avvengono in maniera diversa in funzione del pH della soluzione, e cellule e batteri hanno bisogno di condizioni precise di pH e temperatura per crescere correttamente.
Cos’è e come preparare una soluzione tampone è un argomento trattato in lungo e in largo dal punto di vista teorico nei corsi di chimica generale, ma la realtà del laboratorio è tutt’altra cosa!
In questo articolo impareremo in maniera pratica come preparare una soluzione tampone in laboratorio.
Prima di proseguire nella lettura, assicurati però di conoscere bene la teoria. Sono sicuro che questo video farà al caso tuo.
Come preparare una soluzione tempone in laboratorio: scegliere il tampone
Innanzi tutto, dobbiamo identificare i possibili tamponi a cui siamo interessati. Per esempio, per preparare un tampone a pH 7.4 per impieghi in colture cellulari il PBS potrebbe essere un’ottima scelta. Il tampone ammoniacale (NH3/NH4+) non sarebbe invece appropriato. Sebbene in teoria sia possibile prepararlo (potete provare a fare i conti basandovi sulla strategia vista in questo video) nella pratica sarebbe impossibile e, soprattutto, del tutto inefficace. Generalmente, dobbiamo scegliere un tampone in cui la pKa sia il più vicina possibile al pH di nostro interesse. Una variazione di ±1 è generalmente considerate accettabile. Questo vuol dire che un tampone acido acetico/acetato sarà utile nell’intervallo di pH 3.76-5.76, tenuto conto che la pKa dell’acido acetico è 4,76. Non potrò invece utilizzarlo efficacemente per tamponare a pH 2,5 o 6,5. Questa tabella mostra le pKa di alcuni sistemi tampone molto comuni.
| Tampone | pKa |
| Citrato (H3A/H2A–) | 3.13 |
| Acido acetico | 4.76 |
| PBS (H2PO4–/HPO42-) | 7.20 |
| HEPES | 7.48 |
| TRIS | 8.07 |
| Borato | 9.14 |
| Ammonio (NH4+/NH3) | 9.25 |
Anche le proprietà chimiche e biologiche sono importanti. Per esempio, per tamponare una soluzione a pH= 7,4 (il più comune in biologia) potrei utilizzare sia il tampone PBS (Phosphate buffer saline) che HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid) che il TPS, contenente Tris(hydroxymethyl)aminomethane. Del tampone PBS ne esistono inoltre diverse varianti, alcuni contenenti anche cloruro di sodio e cloruro di potassio, altre contenenti anche calcio e magnesio. La scelta dipenderà dalla mia applicazione specifica.
Non solo, ma una volta selezionato il buffer che mi interessa, dovrò verificare cosa è disponibile in laboratorio. Molti tamponi possono essere acquistati come soluzioni concentrate da diluire al momento dell’uso, oppure come pasticche da disciogliere in un volume noto di acqua. In altri casi dovrò pesare direttamente i sali di interesse, ma anche in questo caso dovrò valutare le mie disponibilità. Per esempio, il fosfato biacido di sodio è disponibile sia come solido anidro (NaH2PO4) che come diidrato (Na2HPO4 · 2 H2O). Avendo pesi molecolari diversi, le quantità da aggiungere saranno diverse, e dovrò quindi assicurarmi o di trovare una ricetta che utilizzi esattamente il sale a mia disposizione oppure di fare una conversione.
Come preparare una soluzione tempone in laboratorio: istruzioni generiche
- Per preparare il mio tampone dovrò innanzi tutto verificare se esiste una ricetta già disponibile in letteratura scientifica o da una fonte affidabile. In caso contrario, dovrò effettuare i necessari calcoli sfruttando le conoscenze acquisite sugli equilibri acido-base (o guardando questo video). Attenzione: nel caso di applicazioni biologiche dovrò considerare con attenzione non solo il pH, ma anche l’osmolarità della soluzione finale, che dovrà essere isotonica se necessario.
- Una volta identificata la ricetta, effettuerò le pesate corrette e scioglierò i reagenti in poco più di metà del volume totale di solvente previsto. Per esempio, se la mia ricetta richiede di sciogliere una certa massa di sali in un litro di acqua, in questa prima fase ne verserò solamente circa 6-700 mL. Io consiglio di pesare i sali separatamente su carta oleata o sulle apposite barchette, e poi trasferire tutto in un matraccio tarato, per poi aggiungere la prima porzione di solvente con un cilindro graduato. Se la dissoluzione dovesse essere troppo lenta, valutate di scaldare leggermente la soluzione.
- Una volta che tutti i sali saranno completamente sciolti, verificherò con un pHmetro il pH della soluzione. È fondamentale che la temperatura della soluzione corrisponda a quella di utilizzo effettivo, per cui se per sciogliere i sali avete dovuto scaldare la soluzione ricordate di raffreddarla a temperatura ambiente. Assicuratevi anche che il pHmetro sia correttamente calibrato.
- Se ho lavorato bene e seguito una ricetta attendibile, il pH misurato dovrebbe essere più o meno corretto. Se non lo fosse, sarà necessario correggerlo con una soluzione di HCl 1M o NaOH 1M, o con altri acidi/basi in funzione delle vostre necessità. Anche se la ricetta fosse corretta, potrebbe essere comunque necessario un piccolo aggiustamento in quanto i sali potrebbero essere leggermente umidi, e non dimenticate inoltre che l’acqua può contenere CO2 dissolta, che può renderla leggermente acida
- Una volta effettuata la correzione, diluirò fino a poco meno del volume finale (per esempio, 950 mL su un totale di un litro). Sebbene in teoria il pH di un buffer non dipende dalla sua concentrazione, nella realtà non è così e con la diluizione possono esserci piccoli cambiamenti. Verificherò quindi nuovamente il pH ed eseguirò se necessarie ulteriori correzioni con HCl o NaOH.
- Posso ora portare a volume con attenzione e agitare bene.
- Il buffer è pronto per essere utilizzato!
Attenzione: il pH dipende dalla temperatura. Se devo utilizzare il mio tampone ad una temperatura diversa da quella ambiente, sarà importante che la verifica con il pHmetro e l’eventuale correzione sia effettuata alla temperatura di impiego.
Come preparare una soluzione tempone in laboratorio: istruzioni specifiche
Oltre alle istruzioni generiche che abbiamo scoperto in precedenza, ogni soluzione tampone ha poi le sue peculiarità.
Scopriamo quindi come preparare nel dettaglio alcuni dei tamponi più comuni!
