Semplice, onnipresente e affidabile: chiunque sia mai entrato o entrata in un laboratorio di colture cellulari avrà avuto a che fare con il tampone fosfato salino, più comunemente noto con l’acronimo PBS (Phosphate-buffered saline).
Ma cos’è, esattamente, il PBS? Perché viene utilizzato così spesso nei laboratori? Come preparare una soluzione di PBS?
Come intuibile dal nome, è una soluzione tampone acquosa a base di sali fosfato, è atossica, ed è generalmente preparata in modo da avere un pH vicino alla neutralità (comunemente pH=7,4).
Molti processi biologici sono sensibili anche a piccole variazioni di pH. Il PBS aiuta a mantenere condizioni fisiologiche, evitando che reazioni cellulari o proteiche vengano alterate da variazioni di acidità o basicità causate dal metabolismo cellulare, dall’assorbimento di CO2 dall’aria o da eventuali altre molecole aggiunte durante l’esperimento.
Oltre a garantire un pH simile a quello fisiologico, il PBS è isotonico con le cellule, ovvero ha la loro stessa pressione osmotica. Questo lo rende ideale per manipolazioni biologiche senza causare danni, ed è spesso utilizzato per lavare le cellule prima di un’analisi, diluire reagenti o rimuovere sostanze non legate (ad esempio negli esperimenti di immunofluorescenza o Western blot). La sua “neutralità” lo rende perfetto per questi compiti.
Può essere usato a temperatura ambiente o riscaldato, può essere sterile o meno, e si conserva facilmente. Inoltre, può essere arricchito con altri componenti (come l’EDTA) a seconda delle necessità sperimentali.
Linee guida generali
Se non hai mai preparato una soluzione tampone, ricorda di leggere questo articolo dove troverai tutte le informazioni necessarie.
Se vuoi fare un ripasso di teoria, ecco un video che potrebbe fare al caso tuo.
Ricorda inoltre che il pH dipende dalla temperatura. Assicurati quindi che tutte le operazioni di preparazioni del buffer e verifica del pH siano effettuate alla temperatura di utilizzo effettivo.
Come si prepara il PBS a pH=7.4 a partire dalle compresse
Il metodo più semplice per preparare il PBS è quello di utilizzare le compresse. I sali che costituiscono il tampone sono già pre-pesati e premiscelati e venduti sottoforma di compresse disponibili all’interno di una confezione protettiva.
Una volta rimosse dalla confezione, le compresse possono essere disciolte in un volume di acqua nota, spesso un litro. Generalmente il volume nel quale vanno disciolte è comunque riportato nelle istruzioni presenti nella confezione.
La compressa può essere sciolta in un matraccio tarato contenente circa il 75% del volume finale di acqua (quindi 750 mL per un volume finale di 1 L), eventualmente aiutandosi con un po’ di calore se la dissoluzione dovesse essere difficoltosa.
Una volta che la soluzione è perfettamente omogenea e alla temperatura di utilizzo finale, si può verificarne il pH con un pHmetro opportunamente calibrato ed eventualmente correggere con HCl 1M o NaOH 1M. Portare quindi a volume con acqua.
Come si prepara il PBS a pH=7.4 a partire dai sali
Come preparare una soluzione di PBS?
La versione più popolare del PBS è il Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS), specialmente nella variante riportata nel giornale Cold Spring Harbor Protocols (https://cshprotocols.cshlp.org/content/2006/1/pdb.rec8247)
La composizione è la seguente:
| Componente | Formula | Massa (grammi per litro di soluzione) | Concentrazione (mM) |
| Fosfato biacido di potassio | KH2PO4 | 0.24 | 18 |
| Idrogenofosfato di sodio | Na2HPO4 | 1.44 | 100 |
| Cloruro di sodio | NaCl | 8.00 | 1.4 |
| Cloruro di potassio | KCl | 0.20 | 27 |
Le quantità riportate sono quelle necessarie per preparare un litro di soluzione. Se è necessario un volume diverso, basterà moltiplicare la massa per il volume richiesto (in litri). Per esempio, per preparare 250 mL di PBS dovrò moltiplicare la massa di ogni sale per 0.25 (250 mL= 0.25L).
Nel caso in cui il fosfato monoacido di sodio sia disponibile non come sale anidro (Na2HPO4) ma nella versione diidrata Na2HPO4 · 2H2O, allora la massa da pesare andrà moltiplicata per 1,25.
Il processo da seguire è quello già visto per la preparazione dei tamponi in laboratorio.
In linea generale, il primo step consiste nel pesare tutti i sali con la giusta accuratezza. Dato che le quantità di fosfato biacido di potassio e di cloruro di potassio sono abbastanza basse, si consiglia di utilizzare una bilancia analitica.
Trasferisci quindi i sali in un matraccio o in una bottiglia tarata. Aiutati con un po’ di acqua contenuta in una spruzzetta per trasferire tutto il solido in maniera quantitativa.
Aggiungi acqua fino a circa il 75% del volume finale, quindi agita bene fino a dissoluzione completa. Questa operazione (specialmente d’inverno!) potrebbe richiedere molto tempo, quindi se necessario puoi aiutarti scaldando leggermente la soluzione fino a completo scioglimento di tutti i sali.
Una volta che la soluzione sarà perfettamente limpida misura il pH ed esegui le necessarie correzioni utilizzando una soluzione di HCl o di NaOH.
Quando sarai soddisfatto del pH raggiunto, aggiungi l’acqua restante per arrivare al volume finale.
